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ku游体育:主动代谢在实时细胞内NMR中揭示了功能性蛋白质间相互作

时间:2020-05-21 21:30    作者:ku游体育     点击:

ku游体育:主动代谢在实时细胞内NMR中揭示了功能性蛋白质间相互作用

抽象

蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)是大多数细胞过程的基础,但是许多PPI取决于特定的代谢状态,这种状态只能在活泼,活跃的代谢细胞中观察到。实时细胞核磁共振波谱(RT-NMR)利用生物反应器将细胞维持在活跃的代谢状态。生物反应器技术的改进可在长达24小时内将ATP水平维持在> 95%,从而使蛋白过表达以及原核泛素样蛋白Pup和分支杆菌蛋白酶ATPase Mpa之间以前未被发现的相互作用得以检测。尽管由于高度活跃的代谢组而导致背景信号变化很大,但在Mpa过表达过程中收集的NMR光谱的奇异值分解SVD仍可轻松识别PPI。

介绍

表征功能蛋白质-蛋白质相互作用,质子泵抑制剂,活细胞内对于理解生物学活性的起源必不可少123。PPI是大多数细胞过程的基础,尽管已成为挑战性药物靶标,但已广受欢迎。挑战的部分原因是由于PPI产生的全部活性可能取决于特定的代谢状态,该状态只能在活的,活跃代谢的细胞中实现,在这些细胞中,相互作用的表面受到代谢组及其副产物的整体调节45。细胞内NMR光谱通过收集NMR活性核标记的蛋白质靶标上的NMR光谱部分地克服了这个问题,主要是15N和13 C,在活细胞内67891011
保持活性代谢和高度的细胞生存力的仍然是主要的障碍121314,以在大多数小区NMR工作。在长时间的实验中,细胞死亡是常见的,并且彻底采用对照来确保信号来自完整细胞内。在细胞NMR谱收集使用静态或代谢不活跃的细胞不准确地反映交互网络,相互作用组研究中的作用,目标分子上121516。引入生物反应器1213141718不断引入新鲜的生长培养基并去除废物的物质,通过建立更有利于细胞生长的条件来帮助缓解这一问题。
我们生物反应器的原始设计可在大肠杆菌中持续代谢能量长达24小时,而ATP,ADP,NAD +和NAD(H)浓度损失约40%,这与> 90%的细胞活力和有限的细胞生长相一致13。然而,细胞需要持续高水平的能量电荷来维持完整的代谢过程,例如转录,翻译,复制和其他ATP依赖性过程。这项研究中提出的改进使大肠杆菌中的ATP含量高,足以实现蛋白质表达和旺盛生长。通过维持高度活跃的细胞新陈代谢,可以通过结合实时,RT和结构相互作用来鉴定ATP依赖性功能性PPI,STINT 8,细胞内NMR 13
分枝杆菌蛋白酶体系统19用于说明研究细胞内功能性PPI的重要性。在分枝杆菌中,通过原核泛素样蛋白Pup的翻译后修饰,将蛋白质靶向分枝杆菌蛋白酶ATPase Mpa和20S蛋白酶体。Pupylation影响高达5%的结核分枝杆菌结核分枝杆菌,蛋白质组202122。小狗-蛋白酶体系统在被巨噬细胞的持续感染有牵连Mtb并且被认为是重要的药物靶标232425
在这项工作,使用改良版的生物反应器重新检查了大肠杆菌中的Pup-Mpa相互作用,该反应器可维持长达24小时的高细胞代谢,足以支持细胞的旺盛生长。大肠杆菌被用于从天然宿主中不希望的Mtb蛋白酶体因子中分离出Pup-Mpa系统。观察到的功能性蛋白质-蛋白质相互作用只能在存在活性代谢组的情况下发生。

结果

将细胞维持在代谢活跃状态的能力对于任何细胞内NMR研究的成功至关重要13。在不存在生物反应器的细胞内NMR实验过程中,由于收集了NMR光谱,大量细胞被悬浮在NMR缓冲液中数小时。在这段时间中,产生了废物,并且细胞的pH和氧化还原状态正在改变,当蛋白质与细胞环境12反应时,这可能导致NMR光谱的变化。细胞环境的变化最终导致细胞死亡和靶蛋白从细胞中漏出,从而产生核磁共振波谱,这是细胞内蛋白和游离蛋白的组合。

改进的生物反应

ku酷游改进的生物反应器的示意图在图1和补充图  1中示出  。将细胞保持在310 K,并在315 K下孵育的新鲜培养基中,以确保从储层到NMR管的转移过程中温度下降。通过用超高分子量,UHMW,微孔亲水聚乙烯扩散器代替原来的滴流孔口13,开发出了一种增强的系统,可以使细胞最大程度地接触新鲜培养基。扩散器的孔隙范围为50–100μm,可在〜63 mm 2的较大表面积上均匀分散介质。
 
为了在NMR采样体积内保持高浓度的细胞,使用雾化器将大肠杆菌细胞封装到1%藻酸盐珠中。雾化产生珠子26的高度可再现的均匀分散(图  2a)。与琼脂糖线不同,藻酸盐会随着细胞的生长而膨胀。用大肠杆菌浇铸的藻酸盐珠的平均直径为0.83±0.03 mm;在生物反应器中放置24小时后,直径增加到0.90±0.04 mm,相当于体积增加了大约25%(补充图  2)。)。尽管某些细胞从基质中弹出,但采样体积内的总细胞密度保持恒定,从而保持了信号强度。扩散器提供的均匀介质分散可最大程度地减少流动介质在铸珠上的向上阻力,从而防止其在样品体积中移动。从藻酸盐基质喷出的细胞被介质流冲走,对光谱没有贡献。

延长细胞活

在ku酷游先前进行的工作27表明,基于腺苷酸能电荷,可将大肠杆菌细胞活力分为三类。在高ATP浓度下,细胞会旺盛生长并表现出高代谢活性。在生长周期后或碳饥饿期间,ATP的水平缓慢下降,从而保留了细胞活力和形成菌落的能力。随着ATP浓度的降低,甚至发生了进一步的代谢失活或细胞死亡。对细胞活力的清晰描述使大肠杆菌成为优化细胞内NMR光谱以鉴定最大代谢水平和最高细胞ATP水平下功能性PPI的良好选择。
在有或没有新鲜培养基流动的情况下,都可以监测生物反应器中大肠杆菌细胞的活力(图  2b和c)。由于细胞内ATP的浓度随着细胞进入生长的不同阶段而发生变化28,因此在细胞内NMR实验过程中,收集到31 P光谱以监测含磷酸盐的代谢产物,ATP,ADP,NAD +和NAD的水平(H)1829。ATP尤其是代谢活性的关键指标。在流动条件下,细胞活力保持稳定24小时。在没有流动的情况下,含磷酸盐的代谢产物水平在8小时内下降了10%,在12小时内下降了30%,在24小时后下降了40%(图  2c)。)。持续高水平的含磷酸盐代谢产物与高能量电荷和旺盛的代谢活跃细胞相一致。

蛋白质过表

为了证明大肠杆菌在改进的生物反应器蛋白质中的高代谢活性,实时进行了过量表达。最佳的生物反应器蛋白质过表达需要设计一种改良的生长培养基,其中含有最少量的磷酸盐30。来自藻酸盐的钙的磷酸盐螯合破坏包封的珠并将细胞释放到培养基31中。杂交生长培养基HGM与M9 32相似,但用HEPES缓冲并补充[ U- 15 N] ISOGRO粉末,以均匀地标记15 N的目标蛋白。对于未标记蛋白的过表达,将ISOGRO替换为酵母提取物和胰蛋白p。
未标记的分枝杆菌蛋白酶ATPase Mpa的生物反应器过表达在台式机上于310 K在24小时内进行。每隔2 h取出样品,并在10%变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳(图  3a)。由于细胞内蛋白酶降解过表达的蛋白质,Mpa的浓度在12小时内稳定增加,并在最后12小时内降低。该实验证明了生物反应器以足够高的腺苷酸电荷维持细胞处于高代谢状态的能力,以维持蛋白质依赖的ATP依赖过程。

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